Τεχνολογική Βάση

Η Διαδικασία του Oncotype DX

Το Oncotype DX, ως μια πολύ-γονιδιακή ανάλυση, έχει σχεδιαστεί για να υποστηρίζει την επιλογή εξατομικευμένης θεραπείας. Η ανάλυση αυτή παρέχει έναν ποσοτικοποιημένο υπολογισμό της πιθανότητας του οφέλους από τη χημειοθεραπεία και της εμφάνισης απόμακρων υποτροπών, που μπορεί να αυξήσουν την σιγουριά, ότι το θεραπευτικό πλάνο είναι φτιαγμένο ειδικά για τον κάθε ασθενή.

Η ανάλυση Oncotype DX εκτελείται στα εργαστήρια της Genomic Health όπου και αναπτύχθηκε η ανάλυση. Πρώτα εξάγεται το RNA από το δείγμα του καρκινικού ιστού του μαστού και καθαρίζεται. Μετά, το RNA αναλύεται χρησιμοποιώντας μια τεχνική γνωστή ως PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR). Στο τέλος, υπολογίζεται ο Βαθμός Υποτροπής (Recurrence Score) από τα αποτελέσματα της έκφρασης των γονιδίων.

Πλεονεκτήματα της RT-PCR

Το Oncotype DX αναλύει την έκφραση ενός πάνελ 21 γονιδίων από το δείγμα του όγκου χρησιμοποιώντας μια τεχνική γνωστή ως RT-PCR. Για αυτό το λόγο, αναπτύχθηκε μια μέθοδος υψηλής απόδοσης RT-PCR πραγματικού χρόνου(real-time RT-PCR), για να αναλύσει την έκφραση επιλεγμένων γονιδίων ταυτόχρονα. Είναι ευαίσθητη, έχει ειδικότητα, μεγάλο δυναμικό φάσμα και επαναληψημότητα. Η RT-PCR είναι μια επικυρωμένη τεχνολογία που χρησιμοποιείται κατά κόρον σε πολλές κλινικές εφαρμογές συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης ιικού φορτίου για το HIV.

Για την ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης, το RNA εξάγεται από τον καρκινικό ιστό εγκλεισμένο σε παραφίνη (FPET) και υπόκειται σε DNase I διεργασία. Μετράται η περιεκτικότητα του ολικού RNA και πιστοποιείται η απουσία επιμολύνσεων DNA. Εκτελείται αντίστροφη μεταγραφή και ακολουθείται από ποσοτικές TaqMan® (Roche Molecular Systems, Inc.) RT-PCR αντιδράσεις σε 384-well plates. Η έκφραση κάθε ενός από τα 16 γονίδια μετράται εις τριπλούν και μετά εξομαλύνεται σε σχέση με τα πέντε γονίδια αναφοράς.

Οι τυποποιημένες μέθοδοι ανάλυσης του Oncotype DX έχουν βελτιστοποιηθεί προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η μεταβλητότητα λόγω:

• Προετοιμασίας του ιστού: FPET vs. Κατεψυγμένος ιστός
• Ηλικίας του κύβου, τρόπος φύλαξής του και ποικιλομορφία στην προετοιμασία του
• Ετερογένειας στον ίδιο το κύβο και μεταξύ κύβων
• Ετερογένειας σε σχέση με τον καρκινικό ιστό και μη-καρκινικό ιστό στον ίδιο κύβο

Η Ανάπτυξη του Oncotype DX

Το Oncotype DX αναπτύχθηκε σε τέσσερα διαδοχικά βήματα. Κάθε ένα από αυτά τα βήματα περιγράφεται παρακάτω.

1. Βελτιστοποίηση των μεθόδων ποσοτικοποίησης γονιδιακής έκφρασης σε ιστό εγκλεισμένο σε κύβο παραφίνης (FPET)
2. Επιλογή 250 υποψήφιων γονιδίων από το ανθρώπινο γονιδίωμα
3. Ανάλυση των υποψηφίων γονιδίων για να ταυτοποιηθεί το σωστό πάνελ γονιδίων προς κλινική πιστοποίηση
4. Προοπτική κλινική πιστοποίηση του πάνελ των 21 γονιδίων και του υπολογισμού του Βαθμού Υποτροπής (Recurrence Score)

Βήμα 1. Βελτιστοποίηση των μεθόδων ποσοτικοποίησης γονιδιακής έκφρασης σε ιστό εγκλεισμένο σε κύβο παραφίνης

Η δυνατότητα να γίνεται η ανάλυση σε κύβο παραφίνης είναι υψίστης σημασίας καθώς έτσι διατηρείται και φυλάσσεται ο ιστός παγκοσμίως. Όταν ο ιστός συντηρείται σε παραφίνη το RNA κερματίζεται. Παρόλα αυτά, η σχετική αναλογία RNA μεταξύ των γονιδίων παραμένει αμετάβλητη. Με την χρήση της τεχνικής RT-PCR μπορεί να καθοριστεί η έκφραση των περισσότερων γονιδίων – σε σχέση με κάποια γονίδια αναφοράς. Για την ανάπτυξη του Oncotype DX, οι ερευνητές της Genomic Health βελτιστοποίησαν την τεχνολογία RT-PCR 1) για υψηλή απόδοση, ποσοτικοποίηση πραγματικού χρόνου συγκεκριμένου RNA σε κύβο παραφίνης (FPET) και 2) προκειμένου να έχει επαναληψημότητα ανεξάρτητα από τον τρόπο μονιμοποίησης και φύλαξης του κύβου παραφίνης.

Βήμα 2. Επιλογή 250 υποψηφίων γονιδίων από το ανθρώπινο γονιδίωμα.

Ερευνητές της Genomic Health βασίστηκαν σε πολυάριθμες πηγές για να ταυτοποιήσουν 250 υποψήφια γονίδια —αυτά που πιθανώς σχετίζονται με την συμπεριφορά του καρκίνου του μαστού- μεταξύ 25.000 γονιδίων στο ανθρώπινο γονιδίωμα.

Βήμα 3. Ανάλυση των υποψηφίων γονιδίων για να ταυτοποιηθεί το σωστό πάνελ γονιδίων προς κλινική πιστοποίηση

Τα 250 υποψήφια γονίδια αναλύθηκαν σε συνολικά 447 ασθενείς σε τρείς ανεξάρτητες κλινικές μελέτες προκειμένου να ταυτοποιηθεί ένα πάνελ γονιδίων στενά σχετιζόμενο με επιβίωση άνευ απόμακρων υποτροπών (distant recurrence-free survival). Η επιλογή των 16 καρκινικών γονιδίων που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση Oncotype DX βασίστηκε στο αποτέλεσμα των τριών κλινικών μελετών, που έδειξαν συνεχή και ισχυρή στατιστική συσχέτιση ανάμεσα σε αυτά τα γονίδια και την απόμακρη υποτροπή καρκίνου μαστού. Ταυτοποιήθηκαν επίσης και πέντε γονίδια αναφοράς για να εξομαλύνουν την έκφραση των καρκινικών γονιδίων που προαναφέρθηκαν. Επιπλέον αυτές οι μελέτες αποτέλεσαν τη βάση για τον υπολογισμό του Recurrence Score, το οποίο συνδυάζει τα δεδομένα της έκφρασης των γονιδίων του πάνελ σε ένα μοναδικό αποτέλεσμα.

Βήμα 4. Προοπτική κλινική πιστοποίηση του πάνελ των 21 γονιδίων και του υπολογισμού του Βαθμού Υποτροπής (Recurrence Score)

Το γονιδιακό πάνελ Oncotype DX και ο υπολογισμός του Βαθμού Υποτροπής (Recurrence Score) πιστοποιήθηκαν σε μια μεγάλη, ανεξάρτητη, πολυκεντρική μελέτη (NSABP Study B-14) και σε μια μεγάλη population-based case-control μελέτη σε ασθενείς με καρκίνο μαστού στο Northern California Kaiser Permanente. Οι στόχοι και το πλάνο ανάλυσης καθορίστηκαν προοπτικά. Τα αποτελέσματα αυτών τα των μελετών ανακοινώθηκαν στη συνεδρία “Best of Oncology” στο ASCO 2004 και τα αποτελέσματα της μελέτης κλινικής πιστοποίησης NSABP B-14 δημοσιεύτηκαν στο The New England Journal of Medicine (30 Δεκεμβρίου, 2004).

Πάνελ 21-γονιδίων Για τον Υπολογισμό του Βαθμού Υποτροπής (Recurrence Score)

Το πάνελ των γονιδίων του Oncotype DX επιλέχθηκε από τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία, μια γενωμική βάση δεδομένων και πειράματα βασισμένα σε συστοιχίες DNA σε φρέσκο κατεψυγμένο ιστό. Ο αλγόριθμος του Recurrence Score δημιουργήθηκε από 3 μελέτες σε ασθενείς με καρκίνο μαστού και μετά πιστοποιήθηκε κλινικά με πολλαπλές ανεξάρτητες μελέτες.

• Ο Βαθμός Υποτροπής (Recurrence Score) υπολογίζεται από την έκφραση 16 καρκινικών γονιδίων και 5 γονιδίων αναφοράς που χρησιμοποιούνται για την εξομάλυνση της έκφρασης των καρκινικών γονιδίων.
• Στις κλινικές μελέτες, τα 16 καρκινικά γονίδια υπέδειξαν μια συνεχή στατιστική συσχέτιση με την απόμακρη υποτροπή του καρκίνου του μαστού, καθώς και έντονη προβλεπτική δύναμη σχετικά με το όφελος από τη χημειοθεραπεία.

Πάνελ 21 –Γονιδίων για τον Υπολογισμό του Recurrence Score:

16 καρκινικά γονίδια και
5 γονίδια αναφοράς από
3 μελέτες